Gen haritalaması, genlerin kromozomlar üzerinde bulunduğu yerlerin (lokus) gösterilmesidir. Böylece insan genomunun anatomisi ortaya çıkarılır. Pekçok genin ve diğer genetik marker`larin birbirlerine göre bir kromozom boyunca diziliş sırasının haritalanmasıyla bir kromozomun haritasını veya tüm genom haritasını çıkarmak mümkündür. Bu haritalama, insan vücudu fonksiyonlarının bilinmesi için gereklidir. Böylece insan genetik hastalıklarının heterojenite ve segregasyon analizleri bu bilgiler ışığında yapılabilecek ve gen tedavisi gerçekleştirilebilecektir.

Sitogenetik haritalama, genetik haritalama ve fiziksel haritalama olmak üzere temelde üç tip gen haritası vardır.

Sitogenetik haritalar, ilk olarak sitogenetik bantlama tekniklerinin oluşturulmasıyla farklı kromozomları tanımanın yanında, subkromozomal bölgelerin de ayırdedilmesiyle ortaya çıkmıştır. Bu tür haritalar düşük rezolüsyonlu (yaklasık 6Mb) olmakla birlikte genlerin ve diğer DNA dizilerinin haritalanmasında çok basit bir yöntem olan kromozom in situ hibridizasyonu için zemin hazırlamıştır. Böylece uygun koşullarda yapılan hibridizasyondan sonra elde edilen sinyal probla, tanınan DNA dizisinin bir harita lokasyonunun tanımlanması sağlanabilir. Günümüzde in situ hibridizasyon teknikleri floresan in situ hibridizasyon olarak geliştirilmiştir. Yöntem, belirli bir DNA bölgesi kullanarak tüm kromozomlar içinde eşdeğer bölgeyi bulmak şeklinde uygulanır. DNA bölgesi, radyoizotopla veya floresanla işaretlendikten sonra ısıtma ve soğutma işlemlerini takiben tek iplik haline getirilir. Boyanmamış ve lam üzerinde yayılmış metafazlara uygulanır. Hazırlanan prob, metafazda yer alan kromozomlardan kendi ile eşdeğer bölgesi ile birleşir (1). Floresan kullanılarak geliştirilen yeni yöntemler, çok kısa sürede klonlanmış DNA dizilerinin haritalamasında kullanılmaktadır. Son yıllarda birden fazla farklı renkli floresan işaretli problarla, kısa sürede daha fazla bölge incelenebilmektedir. Ayrıca fenotipin, gözlemlenebilir kromozomal yeniden düzenlenmeleri ya da kromozomal eksikliklerle ilişkilendirilmesiyle de sitogenetik haritalar oluşturulabilmiştir. Bunun yanında translokasyonlar ve kromozomal delesyonlardan türemiş parçaları içeren somatik hücre hibridleriyle doğal kromozom kırık noktaları ya da radyasyon hibridleri kullanarak yapay kırık noktaları haritalanabilir. Aynı zamanda düşük resolusyonlu fiziksel haritalar olarak da adlandırılan bu sitogenetik haritalarda çözünürlük, genellikle birkaç megabaz uzunluğundadır (2).

Somatik hücre hibrid çalışmaları ile de, kromozomlar ve onlar üzerindeki genlerin haritalaması çalışmaları yapılmıştır. En sıklıkla fare ve insan olmak üzere iki farklı tür somatik hücreler, birleştirici bir ajan veya özel inaktif viruslar aracılığı ile birleştirilir. Farklı farklı fare insan hibrid hücre klonları elde edilir. Başlangıçta bu klonlardaki hibrid hücrelerde hem insan hem fare kromozomları bulunurken, insan kromozomlarının bazıları her klonda farklı olmak üzere selektif olarak kaybolur. Özel bantlama yöntemleri ile morfolojik olarak, fare ve insan kromozomları kolayca ayırt edildiğinden hangi kromozom kaybı ile hangi özelliğin etkilendiği belirlenmeye çalışılmıştır. Örneğin bir enzim aktivitesi açısından fare somatik hücresinde eksiklik varsa, ama hibrid hücrede bu eksiklik gözlenmi-yorsa hangi insan kromozomu üzerinde bu enzimin geninin bulunmakta olduğu belirlenmiştir. Somatik hücre hibridizasyon yöntemi ile ilk gen haritalaması, timidin kinaz enzim lokusunun 17 nolu kromozom üzerinde olduğunun gösterilmesi ile gerçekleştirilmiştir (3).

Genetik haritalama, kısaca genomun matematiksel analizi olarak bilinir ve genlerin kromozomlar üzerindeki lokalizasyonlarının bulunmasında moleküler biyolojik yöntemler ve bir dizi karmaşık istatistiksel analizleri kullanır (4). Özellikle genetik etyolojili hastalıkların lokalizasyonlarının saptanması alanında son derece verimli bir metod olarak karşımıza çıkmaktadır. Metod en genel anlamı ile lokalizasyonu aranan gen ile lokalizasyonu bilinen bir genetik belirleyicinin (“marker”) kuşaklar arasında birlikte kalıtılması-nın test edilmesi esasına dayanır. Bilindiği gibi kromozomlar mayozda karşı karşıya gelerek parça değişimine uğrarlar (“crossing-over”). Bu parça değişimleri sırasın-da birbirine yakın genler sıklıkla bir arada giderler. Uzak yerleşimli genler ise bağımsız tertiplenme kura-lına göre rastgele olarak bir arada gidebilirler ya da ayrılırlar. Böylelikle yavru kuşaklarda ebeveynlerde olmayan yeni yapılanmalar ortaya çıkar. Bu olaya “rekombinasyon” olayı, ortaya çıkan ürünlere de “rekom-binant” ürünler denir (Şekil 1). Rekombinasyon kavra-mı genetik haritalama’nın kalbini oluşturur. Temel hipotez “eğer aradığım gen kromozom lokalizasyo-nunu bildiğim marker’a çok yakınsa mayozda birbirlerinden ayrılamayacak ve kuşaklar arasında daima marker allel ile birlikte kalıtılacaktır” şeklinde özetlenebilir. Başka bir deyişle yavru kuşaklarda rekombinant bireylerin fazla sayıda bulunması aradığımız genden uzaklaştığımız anlamına gelecektir. Bu yolla marker allel’in yeri bilindiğine göre (örneğin 2p13 bandı) ilgilendiğimiz genin ya da hastalığın yeri de bulunmuş olacaktır.

Rekombinasyon birimi centimorgan (cM) ile ifade edilir. 1cM her 100 kişide 1 rekombinant birey olduğunun göstergesidir (1/100=0.01) ve  (theta) işareti ile gösterilir. Genetik uzaklıklar fiziksel anlamda ölçülebilir uzaklıklar değildir. Teorik olarak iki lokus arasında 1cM’lık bir uzaklıktan söz edildiği zaman, yaklaşık 1 milyon baz çiftinden söz ediliyor demektir. Ancak bu her zaman kesin değildir. Sık rekombinasyon yapan bölgelerde (rekombinasyon hot spot’lari) 2-3 cM’lik bölgeler fiziksel anlamda bazen beklendiğinden çok daha kısa olabilirler.

Bu metod yolu ile bir gen haritalama çalışmasını yapabilmek için kuşaklar arası kalıtımı izleyebileceğimiz ailelere ihtiyaç vardır. Yine hipotezimizi oluşturmak için kalıtım kalıbının belirlenmesi (tek gen, kompleks, mitokondrial vs.) ve marker kavramından ne anladığımızın iyice açıklanması gerekmektedir. Genetik haritalama işlemi, farklı moleküler biyolojik yöntemleri teknik olarak kullanmakla birlikte temel olarak istatistiksel bir analizdir ve tüm istatistik yöntemlerde olduğu gibi etkin bir genetik haritalama yapabilmek için hipoteze yönelik parametrelerin çok sağlam olarak belirlenmesi gerekir. Bu metod kullanılarak herhangi bir nitelik (gen, marker, hastalık gibi) haritalanmaktaysa da en geniş kullanım alanını, genetik hastalıkların haritalanması oluşturmaktadır. Bu noktada genetik etkenlere bağlı olduğunu düşündüğümüz bir hastalığın gen haritalamasını yapmak istediğimizi varsayalım ve bu işlem için gerekli aşamalar, nedenleri ve zorunlu parametreleri üzerinde tartışalım.

1. Haritalanacak fenotipin özellikleri iyi tanımlanmalıdır: Fenotip: Bir varlığın genler ve çevre etkileşimleri sonucu türlü metodlar ile ortaya konulabilen özelliklerinin tümü olarak tanımlanabilir (5). Gen haritalamasının ilk aşaması haritalanacak genin, hastalığın, ya da karakterin özelliklerinin standartlar oluşturarak saptanmasıdır. Gen harita-lama çalışmalarında genellikle çok sayıda aileden toplanmış örneklere ihtiyaç vardır. Bu nedenle birden fazla merkez örnek toplama işlemine katılır. Merkezler arasında fenotip karmaşası yaşandığı durumda gen haritalama çalışması yapmanın imkanı yoktur. Yine psikiyatrik hastalıklar gibi hastalık spektrumunun kesinlikle belirlenemediği durum-larda gen haritalama çalışmaları sıklıkla başarısız-lıkla sonuçlanır.

2. Haritalamada kullanılacak metoda karar verilmeli ve kalıtım kalıbı olabildiğince kesin olarak belirlenmelidir. Kalıtım kalıbının saptanmasının gen haritalama için seçilecek metodun belirlenmesi ile çok yakın ilgisi vardır. Gen haritalama metodları başlıca iki ana gruba ayrılır.

a) Parametrik metodlar: Temel olarak Linkage (Bağlantı) analizleri olarak bilinir (Ülkemizde kullanılan terim linkaj analizidir ve metin içinde bu şekilde kullanılacaktır). Linkaj analizinin başarılı olabilmesi için değişmez parametrelere ihtiyaç vardır. Bunlar: 1- kalıtım kalıbı kesin olarak bilinmelidir; 2- üç kuşaklı geniş aileler tercih nedenidir 3- örnek toplama yaklaşımı kalıtım kalıbına göre olur. Örneğin otozomal dominant bir gen ile kalıtılan bir hastalık haritalanmak isteniyorsa örnek toparlama hasta bireyler, varsa eşleri ve tüm çocukları yanısıra, normal bireylerin sadece kendileri şeklinde olmalıdır. Otozomal resesif bir hastalık söz konusu olduğu zaman ise, sıklıkla taşıyıcı olan anne-baba ve tüm çocuklarının toplanması yeterlidir. Pedigri (aile ağacı) analizleri yapılmaksızın sadece sporadik vakalar üzerinden linkaj analizini uygulayabilmenin imkanı yoktur (6). Şekil 2’de otozomal dominant bir genle kalıtılan bir hastalık üzerinden linkaj analizi görülmektedir.

b) Non-parametrik metodlar: Niteliklerin kalıtım kalıplarını belirlemek her zaman kolay değildir. Pek çok genetik nitelik çok faktörlü bir kalıtım kalıbı gösterir ve bunlar için hipotez oluşturmakta zorluklar yaşanır. Yine her zaman birkaç kuşağı bir arada bulmak ve örneklemek olanaksızdır. Özellikle geç yaşta başlayan hastalıklarda genellikle önceki kuşaklar ölmüştür, genç kuşaklarda ise henüz hastalık ortaya çıkmamıştır. Bu durumda, eksiklikler göz önüne alınarak parametrelerden bağımsız olan non-parametrik metodlar diğer bir deyişle assosiyasyon çalışmaları önerilmektedir. Asso-siyasyon çalışmaları için farklı istatistik analizler önerilmişse de bunların hemen hepsinde kuşaklar arası segregasyonun test edilmesinden çok, vaka ve kontroller arasında anlamlı fark olup olmadığı test edilmektedir. Bu metodların linkaj analizine göre avantajları: 1- Kalıtım kalıbının bilinmesine gerek yoktur 2- Ailelerden çok vakaların ve kontrollerin toplanmasına gerek vardır. Dezavantajları ise 1- Örnek sayısı çok fazla olmalıdır 2- Özellikle kontrol grubunun oluşturulmasında çok dikkatli olunmalıdır 3- Sadece bu metoda dayalı gen bulunması maliyeti çok yüksek olan çalışmalardır ve genellikle başarısızlıkla sonlan-mıştır. Şekil 3’te assosiyasyon çalışmalarından anlamlı bir sonuç bulabilmek için ideal olarak seçilmesi gerekli örnek sayıları verilmiştir.

Görüldüğü gibi her iki metodun da birbirine göre avantajları ve dezavantajları vardır. Eğer lokalizasyonu tek başına ispatlayacak büyüklükte aile paneli oluşturulabilmişse ve nitelik tek gen kalıtım modellerinden birini gösteriyorsa seçilecek metod tereddütsüz linkaj olmalıdır. Kompleks niteliklerde assosiyasyon metodlarından birisi seçilebilir. Bu amaçla günümüzde yaygın olarak önerilen iki aşamalı bir çalışma planı izlenmektir (“two stage strategy”) (7). Burada genellikle büyük aileler üzerinden tüm genom taranır. Potansiyel lokus’lar saptandıktan sonra sadece ilgili kromozom bölgelerine yönelik olarak assosiyasyon çalışmaları düzenlenir.

3. Haritalamada kullanılacak marker’lar (genetik belirleyiciler) doğru olarak seçilmeli, mevcut gen haritaları etkin olarak kullanılmalıdır. Bu kısımda gen haritalamasında kullanılan “polimorfik marker” terimini tam olarak anlamak gereklidir. Genetik yapıdaki değişiklikler en genel anlamı ile mutasyon tanımı ile belirlenir. Mutasyonlar toplumda görülme frekansları nadir olan (allel frekansı <0.0001) ve genetik hastalıklardan sorumlu olan değişikliklerdir. Polimorfizm kavramı da yine mutasyon gibi genetik materyaldeki bir değişikliği gösterir ancak çoğu zaman mutasyonda olduğu gibi fenotipik bir değişiklikle sonlanmaz. Polimorfik değişikliklerde, nadir allel frekansı 0.01 dolayındadır yani toplumda yaygın olarak gördüğümüz değişikliklerdir (8). Örneğin genomda hastalıklardan sorumlu olmayan ancak kişiden kişiye farklılık gösteren kısa DNA tekrarlarından oluşan bölgeler vardır. Bunlar STRP (Short Tandem Repeat Polymorphism) olarak adlandırılırlar. Burada ikili, üçlü ya da dörtlü nükleotid tekrarları vardır. Bunlar içerdikleri kopya sayılarına göre DNA örneklerinin farklı büyüklükte olmaları ile sonlanır ve elektroforezde yürütüldükleri zaman farklı büyüklükte bantların görülmesine neden olurlar (Şekil 1). Eğer bir kişiye ait DNA örneği, genomda bu özelliği gösteren bölgelere özgü primerler kullanılarak “Polimeraz zincir reaksiyonu” (PCR, polymeraz chain reaction) yolu ile çoğaltılır ve elektroforezde yürütülecek olursa o kişiye ait polimorfik marker’lardan oluşan bir DNA profili ortaya çıkar. Bu tıpkı parmak izi gibidir, bireyler arasında farklılık gösterir. Birkaç kuşaklı aile bireylerinde böyle bir amplifikasyon yapılırsa kromozomların kuşaklar arasında dağılımı, bu polimorfik marker’lar aracılığı ile belirlenir. Böylelikle baştan beri tartıştığımız kromozomlardaki mayozda oluşan parça değişimleri ve sonundaki olası rekombinant ürünler aile bireylerini birkaç kuşak izleme yolu ile saptanabilir.

İnsan genom projesinde genlerin haritalanması için ilk aşamada planlanan, tüm genomda böyle polimorfik özellikler gösteren markerların bulunması ve sadece bu bölgeleri çoğaltmaya yönelik primer dizinlerinin kromozom lokalizasyonları ve birbirlerine göre sıraları saptanarak bu bilgilerin kullanıma açılması idi. Bu amaçla üç kuşaklı geniş aileler bulunarak örneklendi (CEPH; Centre d’Etudes du Polymorphisme Humanie) (9). Bunlar genomda bulunan polimorfik markerlar için tiplendirildi. Birbirlerine göre olası lokalizas-yonları linkaj analizi yapılarak hesaplandı ve haritalar oluşturulmaya başlandı. Eş zamanlı olarak sitogenetik haritalama da bir kısım markerlar için yapılarak sadece olasılık olarak lokalizasyonları değil kromozom bantlarına göre de lokalizasyonları bulundu. Sitogenetik olarak lokalizasyonları bilinen markerlar referans noktaları olarak kullanılarak genomu 1-2 cM aralıklarla tarayacak haritalar oluşturuldu. Genethon, Evry, Fransa laboratuvarlarında son derece başarılı olarak saptanan bu marker lokalizasyonları, araştırıcıların kullanımına açıldı (9-11). Bunu takiben diğer gen haritalama üniteleri de kendi bulgularını veri bankalarına koydular. Tablo I’de böyle bir haritadaki birimlerin ne anlama geldiğini ve nasıl kullanılacağı gösterilmiştir. Bu haritalara ait bilgilere, The Center for Medical genetics, Marshfield (http://research.marshfieldclinic.org/genetics); Cooperative Human Linkage Center (CHLC) (http://lpg.nci.nih.gov/CHLC); UTAH Genome Center (http://www.genome.utah.edu); The Genome Database (http://gdbwww.gdb.org) internet adresle-rinden ve Genethon haritası için 6 numaralı kaynakçadan ulaşmak mümkündür.

Bu haritalar kullanılırken dikkat edilecek başlıca iki nokta vardır. 1- Haritalar markerların kromozomlar üzerindeki sırasını ve birbirlerine genetik olarak uzaklıklarını vermektedir. Genotipleme yapılırken bu sıraların yanlış tutulması, yerlerinin karıştırılması veya rekombinasyon biriminden (cM), aralarındaki uzaklıklara dikkat edilmemesi gen haritalama çalışmalarının başarısızlıkla sonlanmasına neden olur. 2- Farklı merkezlerin marker haritaları birbirlerine göre ayarlanmamıştır. Başka bir deyişle bir haritadan elde edilen bilgiler ile yapılan bir haritalama çalışması diğer haritalarla uygunluk göstermeyebilir. Bu nedenle genelde tüm harita bilgilerine hakim olarak gerekli çalışmayı yapmak en doğrusudur. Bu noktada tüm veri bankalarındaki verileri karşılaştırmalı olarak bir oranda bünyesinde içeren The Center for Medical Genetics, Marshfield, USA (http://research.marshfieldclinic.org/genetics) veri bankasını referans olarak kullanmak yazarlardan birinin (A.N.A; nakarsu@hacettepe.edu.tr) önerisi olacaktır.

Marker haritalarındaki bilgileri kullanarak yapılacak bir gen haritalaması için başlıca 2 yol seçilebilir:

a- Aday lokalizasyon yaklaşımı: Burada haritala-nacak olan niteliğe ait eldeki bütün veriler göz önüne alınarak aday genler belirlenir. Örneğin baş-boyun bölgesine ait bir malformasyon haritalanacaksa baş ve boyunda ifade bulan ve gelişimsel olarak bu bölgelerin oluşumuna katkıda bulunan genlerden başlamak daha olasıdır. Aday genler belirlendikten sonra bu genlerin hangi kromozom bölgelerinde bulunduğu saptanır ve bu bölgelere sıkı bağlantı gösteren marker’lar öncelikli olarak test edilir. Bu tip marker bilgilerine ulaşmak için OMIM (On-Line Mendelian Inheritance in Man) ve LOCUSLINK internet adresleri en kullanışlı adreslerdir. Bu adreslere National Resource for Molecular Biology Information (NCBI) web sayfasından ulaşılabilir (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Bu veri bankaları birbirleri ile ilişkili olduğu için düşünülen aday gen saptandığı anda, diğer veri bankalarına ulaşılarak ilişkili marker bilgilerini almak olanaklıdır. Aday bölgelerin taranması bitip de herhangi bir lokalizasyon saptanamazsa tüm genomun taranmasına geçilir.

b- Genom taraması (random genome-wide search): Burada hastalığın hangi kromozomda ya da hangi aday gen ile ilişkili olacağına dair bir öngörü yoktur. Genomu 10-20 cM aralıklarla tarayan, kromozom lokalizasyonları belli marker panelleri kullanılarak tüm genom rastgele taranmaya başlanır. İstatistiksel olarak anlamlı sonuç bulunacak kromozom parçasına rastlanılmaya çalışılır. Bazen tüm genom tarandıktan sonra bile lokus saptanmayabilir. O zaman genomu daha sık aralıklarla tarayan (5 cM) marker panellerine geçmek gerekli olabilir. Genomu 20cM aralıkla taramak için gerekli olan marker sayısı yaklaşık 200; 8-10 cM aralıkla taramak için gerekli olan 400 ve 5cM aralıkla taramak için gerekli olan sayı ise 750’den fazladır (10-11). Bu sayıda marker ile çalışma maliyetinin, genotiplenecek örnek sayısı arttıkça artacağı açıktır. O nedenle genom taramaları için genellikle eldeki tüm örnekler kullanılmaz. İstatistiksel olarak en çok bilgi verecek bireylerden oluşan bir başlangıç paneli (initial screening panel) seçilir, genom bu bireyler üzerinden taranır ve potansiyel lokus-ların ispatı ve bölgenin daraltılması için eldeki tüm bireyler kullanılır (saturation mapping)

Buraya kadar anlatılanlardan anlaşılacağı gibi genetik haritalama için kullanılan laboratuvar deneyleri teknik olarak karmaşık bir yapı içermez. Kromozom lokalizasyonu bilinen primerler kullanılarak PCR amplifikasyonu, poliakrilamid jel elektroforezi, boyama ve genotipleme işlemleri yüzlerce kez tekrarlanır. Bu nedenle floresan markerların kullanıldığı ve tek bir çoğaltma işleminde çok sayıda marker kullanılan, otomatik genotipleme yöntemleri geliştirilmiştir. Ancak bu yöntemler zamandan tasarruf sağlarken maliyeti de çok yükseltmektedirler.

Genetik haritalama projelerinde kabul edilmesi gerekli bir diğer önemli nokta da diğer araştırma disiplinlerinden farklı olarak bu tip projelerin hazırlanmasında kesin sınırlarla belirlenen kuralların olmayışıdır. Örnek sayısı, seçilecek metodoloji, marker sayısı ve maliyet, niteliklerin kalıtım kalıplarına, fenotipe, saptanabilen aile sayısına ve en önemlisi şans faktörüne bağlı olarak değişebilir. Tamamen şans eseri olarak taramaya başlanılan ilk lokalizasyonda bağlantının saptanması ile genomu iki kez taradıktan sonra lokalizasyonu bulabilmenin maliyetinin değişeceği açıktır. Kısaca denilebilir ki yapılacak teknik işlem her çalışmada aynı olmasına karşın yorum ve planlama her bir çalışmada farklı özellikler ve tuzaklar içerir.

4. İstatistik değerlendirmeler metoda göre seçilmelidir: Linkaj analizi için; LOD Skor (Logaritm of Odds Ratio) analizi uygulanır. LOD Skor: Linkaj saptanması olasılığının linkaj gözlenmemesi olasılığına oranının logaritmik değerde ifade biçimidir. Başka bir deyişle aranılan genin, test edilen kromozom lokusunda olması olasılığının ilgili lokusta bulunmaması olasılığına oranıdır. Sonuçta çıkan değer arttıkça lokalizasyonun saptanması olasılığı da artacaktır. Örneğin bu değer 5 gibi bir sayı çıkarsa aranılan genin test edilen kromozom lokusundan seçilen marker’a bağlantı göstermesi olasılığı bağlantı olmaması olasılığından 105 kez (100.000 kez) daha fazla olacaktır. Negatif değerler de lokustan uzaklaşıldığının göstergesidir. LOD Skor = 3 ve üstü olan değerler bağlantıyı desteklemesi açısından anlamlı kabul edilirken 2 ve giderek negatifleşen değerler ise kesin olarak bağlantı yokluğunu destekler. Aradaki değerler yoruma açıktır. Lokusun ispatlanabilmesi için bir dizi farklı işlem yapılması gerekebilir (aile ve örnek sayılarının arttırılması, genomun diğer bölgelerinin araştırılması vs. gibi). Burada önemle belirtilmesi gereken nokta bu analizde sonuçta bulunan bir olasılık değeridir ve saptanan lokus hakiki lokus olmayabilir. Nitelikten sorumlu ilgili gen ve gen içi mutasyon gösterilinceye kadar lokus informas-yonu yanıltıcı olabilir.

LOD Skor analizleri için yaygın olarak kullanılan program J. Ott tarafından geliştirilmiş olan LINKAGE paket programıdır (12). Bu program amaca göre kullanılacak 4 alt programdan oluşur (MLINK, ILINK, LODSCORE ve LINKMAP programları). İki lokusun birbirine göre test edilmesi (örneğin, hastalık lokusunun marker allel’e bağlantısı) için en çok MLINK kullanılırken, polimorfik nitelikteki markerların birbirlerine göre lokalizasyonlarının ve sıralarının saptanmasında ILINK programı kullanılmaktadır. LODSCORE tüm olasılıkların hesaplanması yerine sadece maksimum olasılıkların hesaplanmasında, LINKMAP ise birden fazla marker içinde haritalanmak istenen genin göreceli pozisyonunun bulunmasında (“multipoint linkaj analizi”) kullanılan alt programlardır. Programın kullanımı sırasında özellikle parametrelerin belirlendiği dosyaların oluşturulması özellik arz eder. Bu amaçla farklı gen haritalama laboratuvarları LINKAGE programı ile ilişkili ek programlar kullanmaktadırlar. Bu konuda kullanılan tüm programlara http://linkage.rockefeller.edu/soft/list.html adresinden ulaşmak mümkündür.

Assosiyasyon metodları için; Bu alanda en sık kullanılan metodlar şunlardır. 1- Vaka ve kontrol çalışmaları, 2- Identity By Descent (IBD) (13) 3- Sib pair (14), 4- Affected Pedigree Member (APM) (15), 5- Transmission Disequilibrium Test (TDT) (16) ve 6- Haplotype Relative Risk (HRR) (17).

Fiziksel ya da moleküler haritalar, genomik DNA`nın klonlanmış parçalarının düzenlenmesiyle oluşturulurlar ve baz çifti sayılarına göre ayarlanmışlardır. Genetik haritadan farkı burada direkt olarak DNA’yı oluşturan bazların sırası belirlenmiştir. Böylelikle genlerin fiziksel yapıları kesin olarak ortaya konabilmektedir. Haritalama projelerinin en son aşamadaki amacı olan fiziksel harita en yüksek rezolüsyona sahiptir. Diğer yandan, ökaryotik genomun çok küçük bir yüzdesi ifade olunduğu için, bazı fiziksel haritalama yöntemleri, sadece trankripsiyonun gerçekleştiği dizilerin tanımlanmasına yönelmiştir. Genetik haritada olduğu gibi insan genomunun fiziksel haritası da 24 farklı kromozom için oluşturulur. Farklı kromozomlar için bağlantılı polimorfik marker gruplarını gösteren genetik haritaların tersine, farklı tiplerde fiziksel haritalar oluşturmak mümkündür.

Fiziksel haritalamanın en son hedefi DNA baz dizisinin çıkarılmasıdır. Ancak geniş DNA bölgelerinin dizi analizinin yapılması teknik açıdan güç olduğu için haritalamada çözünürlüğü 1 Mb`dan daha aza indiren iki ana yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntemler kullanılarak “Restriksiyon Haritalama” ve doğal olarak uzatılmış ya da yapay olarak uzatılmış kromatin ya da DNA fiberlerinde yüksek çözünürlüklü FISH’dir.

Rekombinant gen teknolojisindeki son gelişmelerle birlikte genomik DNA parçalarının klonlanması ve karakterizasyonuyla detaylı bir gen haritası elde etmek mümkün hale gelmiştir. Sonuçta da sadece gen yapısı hakkında bir kaynak olmakla kalmayan aynı zamanda genomda dizi organizasyonu, gen ve genomların evrimi hakkında da son derece değerli bir kaynak olan tüm bir genomun DNA dizisinin elde edilmesi mümkündür. Günümüzde, pekçok model organizmanın örneğin; bakteri, S.cerevisiae, C.elegans, D.melanogaster, F.rubripes, D.rerio, insan gibi organizmaların genetik ve fiziksel haritalarını çıkararak sonuçta, tüm genom dizilerinin saptanmasını amaçlayan çok yoğun bir şekilde devam eden bir uluslararası işbirliği sürmektedir ve bu model organizmaların bazılarının tüm genom dizi analizi tamamlanmıştır (Tablo II) (18). Genomların haritalanması, analizi ve dizi analizi ile ilgili disipline “genomiks„ adı verilmiştir.

Tüm dünyada binlerce bilim adamının yaklaşık 15 yıl süren çabaları sonucunda insan DNA`sının hemen hemen tamamlanmış nukleotid dizisi yani haritası ortaya çıkmıştır. Gen haritaları sayesinde bitki ve hayvan üreticileri genetik olarak iyileştirilmiş kalitede üretim yapabilirken, insan genom haritasının çıkarılması açısından bakıldığında, biyokimyasal temeli bilinmeyen genetik hastalıklara neden olan genlerin özgül bir kromozom ya da kromozom bantı üzerine haritalanması, soyağaçları üzerinde bir marker ile olan bağlantısına dayanarak bu genin izinin sürülmesi (gene tracking), hastalığın tedavi edilmesi, insan ırklarının evrimleri ve ırkların dünya üzerinde göç yollarının çıkarılması mümkün olacaktır.

Nurten AKARSU
Hacettepe Üniversitesi, Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Araştırma Merkezi, Gen Haritalama Laboratuvarı

Güven LÜLECİ
Akdeniz Üniversitesi Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı